Traducción automática del siguiente documento: https://cormandrostenreview.com/report/
Este documento incluye la carta de presentación y estudio realizado por un grupo de reconocidos ciéntificos a nivel mundial al Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades en el que concluyen que los test PCR no se pueden utilizar como diagnóstico para los virus del SARS (incluido el Covid-19 o SARS-CoV-2).
Carta de solicitud de retractación al consejo editorial de Eurosurveillance
Esta es la carta de solicitud de retractación enviada a Eurosurveillance por el autor principal y coautor, escrita por el Dr. Peter Borger, adjunta a la presentación del Informe de revisión ampliado a través del portal de presentación en línea de Eurosurveillance. La fecha de envío fue el 27 de noviembre de 2020.
26 de noviembre de 2020,Para: Consejo Editorial EurosurveillanceCentro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades (ECDC)Gustav III: s Boulevard 4016973 SolnaSuecia
Asunto: Revisión externa y solicitud de retractación del artículo de Corman et al, publicado en Eurosurveillance el 23 de enero de 2020.
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Informe de revisión Corman-Drosten al Eurosurveillance 2020
Este extenso informe de revisión ha sido presentado oficialmente al consejo editorial de Eurosurveillance el 27 de noviembre de 2020 a través de su portal de envío, adjunto a este informe de revisión hay una carta de solicitud de retractación , firmada por todos los autores principales y coautores. Los primeros y últimos nombres enumerados son el primer y segundo autor principal. Todos los nombres intermedios son coautores.
La revisión por pares externos de la prueba RTPCR para detectar el SARS-CoV-2 revela 10 fallas científicas importantes a nivel molecular y metodológico: consecuencias de los resultados falsos positivos.
Pieter Borger (1) , Bobby Rajesh Malhotra (2) , Michael Yeadon (3) , Clare Craig (4) , Kevin McKernan (5) , Klaus Steger (6) , Paul McSheehy (7) , Lidiya Angelova (8) , Fabio Franchi (9) , Thomas Binder (10) , Henrik Ullrich (11) , Makoto Ohashi (12) , Stefano Scoglio (13) , Marjolein Doesburg-van Kleffens (14) , Dorothea Gilbert (15) , Rainer Klement (16) , Ruth Schruefer (17) , Berber W. Pieksma (18), Jan Bonte (19) , Bruno H. Dalle Carbonare (20) , Kevin P. Corbett (21) , Ulrike Kämmerer (22)
RESUMEN
En la publicación titulada “Detección del nuevo coronavirus 2019 (2019-nCoV) por RT-PCR en tiempo real” (Eurosurveillance 25 (8) 2020) los autores presentan un flujo de trabajo diagnóstico y un protocolo RT-qPCR para la detección y diagnóstico de 2019-nCoV (ahora conocido como SARS-CoV-2), que afirman estar validado, además de ser una metodología de diagnóstico sólida para su uso en entornos de laboratorio de salud pública.
A la luz de todas las consecuencias que resultan de esta misma publicación para las sociedades de todo el mundo, un grupo de investigadores independientes realizó una revisión punto por punto de la publicación mencionada en la que 1) todos los componentes del diseño de prueba presentado fueron verificados en forma cruzada, 2) Las recomendaciones del protocolo RT-qPCR se evaluaron con arreglo a las buenas prácticas de laboratorio y 3) los parámetros se examinaron frente a la literatura científica relevante que cubre el campo.
INFORME DE REVISIÓN CONCISA
El primer y principal problema es que el nuevo Coronavirus SARS-CoV-2 (en la publicación denominada 2019-nCoV y en febrero de 2020 denominada SARS-CoV-2 por un consorcio internacional de expertos en virus) se basa en secuencias in silico (teóricas) , suministrado por un laboratorio en China [1], porque en ese momento los autores no disponían de material de control del SARS-CoV-2 infeccioso ("vivo") o inactivado ni del ARN genómico aislado del virus. Hasta la fecha, la autoría no ha realizado ninguna validación basada en virus SARS-CoV-2 aislados o ARN de longitud completa de los mismos. Según Corman et al .:
"Nuestro objetivo era desarrollar e implementar una metodología de diagnóstico sólida para su uso en entornos de laboratorio de salud pública sin tener disponible material de virus". [1]
El enfoque aquí debe centrarse en los dos objetivos establecidos: a) desarrollo yb) implementación de una prueba de diagnóstico para su uso en entornos de laboratorio de salud pública . Estos objetivos no se pueden alcanzar sin disponer de material viral real (por ejemplo, para determinar la carga viral infecciosa). En cualquier caso, solo un protocolo con la máxima precisión puede ser el objetivo principal y obligatorio en cualquier escenario-resultado de esta magnitud. La determinación de la carga viral crítica es información obligatoria y es responsabilidad del grupo de Christian Drosten realizar estos experimentos y proporcionar los datos cruciales.
“ El establecimiento y validación de un flujo de trabajo de diagnóstico para el cribado y la confirmación específica de 2019-nCoV , diseñado en ausencia de aislamientos de virus disponibles o muestras originales de pacientes. El diseño y la validación fueron posibles gracias a la estrecha relación genética con el SARS-CoV de 2003, y fueron ayudados por el uso de tecnología de ácido nucleico sintético ".
La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es una tecnología biomolecular importante para detectar rápidamente fragmentos de ARN raros, que se conocen de antemano. En el primer paso, las moléculas de ARN presentes en la muestra se transcriben de forma inversa para producir ADNc. A continuación, el cDNA se amplifica en la reacción en cadena de la polimerasa usando un par de cebadores específicos y una enzima DNA polimerasa termoestable. La tecnología es muy sensible y su límite de detección es teóricamente 1 molécula de cDNA. La especificidad de la PCR está muy influenciada por errores de diseño biomolecular.
¿Qué es importante al diseñar una prueba de RT-PCR y la prueba cuantitativa de RT-qPCR descrita en la publicación de Corman-Drosten?
1. Los cebadores y sondas:
2. La temperatura a la que tienen lugar todas las reacciones:
3. El número de ciclos de amplificación (menos de 35; preferiblemente 25-30 ciclos);
En caso de detección de virus,> 35 ciclos solo detecta señales que no se correlacionan con virus infecciosos según lo determinado por aislamiento en cultivo celular [revisado en 2]; Si alguien es probado por PCR como positivo cuando se usa un umbral de 35 ciclos o más (como es el caso en la mayoría de los laboratorios en Europa y EE. UU.), la probabilidad de que dicha persona esté realmente infectada es menos del 3%, la probabilidad de que dicho resultado es un falso positivo es del 97% [revisado en 3]
4. Validaciones biológicas moleculares; Los productos de PCR amplificados deben validarse mediante la ejecución de los productos en un gel con una regla de ADN o mediante la secuenciación directa de ADN.
5. Deben especificarse controles positivos y negativos para confirmar / refutar la detección de virus específicos.
6. Debe haber un procedimiento operativo estándar (POE) disponible
SOP especifica de manera inequívoca los parámetros anteriores, de modo que todos los laboratorios puedan configurar exactamente las mismas condiciones de prueba. Tener un POE universal validado es esencial, porque permite la comparación de datos dentro y entre países.
PREOCUPACIONES MENORES CON EL PAPEL DROSTEN CORMAN
1. En la Tabla 1 del artículo de Corman-Drosten, se indican diferentes abreviaturas: se especifica "nM", no "nm". Además, en lo que respecta a la nomenclatura correcta, nm significa "nanómetro", por lo tanto, nm debe leer nM aquí.
2. Es consenso general escribir secuencias genéticas siempre en la dirección 5'-3 ', incluidos los cebadores inversos. Es muy inusual hacer la alineación con la escritura complementaria inversa de la secuencia del cebador como lo hicieron los autores en la figura 2 del artículo de Corman-Drosten. Aquí, además, una base oscilante se marca como “y” sin descripción de las bases que representan la Y.
3. Dos errores engañosos en el artículo de Corman-Drosten son que su Tabla 1 no incluye valores de Tm (valores de temperatura de recocido), ni muestra valores de GC (número de G y C en las secuencias como% -valor de bases totales).
PRINCIPALES PREOCUPACIONES CON EL PAPEL DROSTEN CORMAN
UN FONDO
B) MÉTODOS Y RESULTADOS
1. Diseño de cebador y sonda
1a) Concentraciones de cebador erróneas
1b) Secuencias de cebador y sonda no especificadas ("oscilantes")
Estas secuencias tambaleantes ya han creado una fuente de preocupación en el campo y han dado lugar a una Carta al Editor escrita por Pillonel et al. [8] sobre errores flagrantes en las secuencias descritas. Estos errores son evidentes en el Corman et al. suplemento también.
El protocolo de la OMS (Figura 1), que se deriva directamente del trabajo de Corman-Drosten, concluye que para confirmar la presencia de SARS-CoV-2, se deben identificar dos genes de control (los genes E y RdRp) en el ensayo. Cabe señalar que el gen RdPd tiene una posición incierta ("tambaleante") en el cebador directo (R = G / A), dos posiciones inciertas en el cebador inverso (R = G / A; S = G / C) y tiene tres posiciones inciertas en la sonda RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C). Por lo tanto, se pueden sintetizar dos cebadores directos diferentes, cuatro cebadores inversos diferentes y ocho sondas distintas para el gen RdPd. ¡Juntos, hay 64 combinaciones posibles de cebadores y sondas!
El artículo de Corman-Drosten identifica además un tercer gen que, según el protocolo de la OMS, no se validó más y se consideró innecesario:
"Es de destacar que el ensayo del gen N también funcionó bien, pero no se sometió a una validación adicional intensiva porque era un poco menos sensible".
Esta fue una omisión desafortunada, ya que sería mejor utilizar los tres genes PCR como ensayos de confirmación, y esto habría resultado en un protocolo de herramienta de diagnóstico de detección de ARN de virus casi suficiente. Tres pasos de ensayo de confirmación al menos minimizarían los errores e incertidumbres en cada paso de plegado con respecto a los puntos "tambaleantes". (No obstante, el protocolo aún no alcanzaría ninguna "buena práctica de laboratorio", si se tienen en cuenta todos los demás errores de diseño).
En su forma actual, el análisis del gen N lamentablemente no se propone en la recomendación de la OMS (Figura 1) como un tercer paso de confirmación obligatorio y crucial, ni se enfatiza en el artículo de Corman-Drosten como una garantía opcional importante "para un flujo de trabajo de rutina". (Tabla 2).
En consecuencia, en casi todos los procedimientos de prueba en todo el mundo, solo se utilizaron 2 coincidencias de cebadores en lugar de las tres. Esta supervisión hace que todo el protocolo de prueba sea inútil con respecto a la entrega de resultados de prueba precisos de importancia real en una pandemia en curso.
Figura 1: El ensayo confirmatorio N-Gene no se destaca como tercer paso necesario en la recomendación oficial del protocolo Drosten-Corman de la OMS a continuación [8] ni se requiere como un paso crucial para una mayor precisión de la prueba en la publicación de Eurosurveillance.
1c) Contenido de GC erróneo (discutido en 2c, junto con la temperatura de recocido (Tm))
1d) Detección de genes virales
No se recomienda la RT-PCR para el diagnóstico primario de infección. Esta es la razón por la que la prueba de RT-PCR utilizada en la rutina clínica para la detección de COVID-19 no está indicada para el diagnóstico de COVID-19 de forma reglamentaria.
“Los médicos deben reconocer la mayor precisión y velocidad de las técnicas de diagnóstico molecular para el diagnóstico de infecciones, pero también deben comprender sus limitaciones. Los resultados de laboratorio siempre deben interpretarse en el contexto de la presentación clínica del paciente, y se requieren el lugar, la calidad y el momento adecuados para la recolección de la muestra para obtener resultados confiables ”. [9]
Por lo tanto, incluso si obtenemos tres señales positivas (es decir, los tres pares de cebadores dan 3 productos de amplificación diferentes) en una muestra, esto no prueba la presencia de un virus. Un mejor diseño de cebador tendría cebadores terminales en ambos extremos del genoma viral. Esto se debe a que todo el genoma viral estaría cubierto y tres señales positivas pueden discriminar mejor entre un virus completo (y por lo tanto potencialmente infeccioso) y genomas virales fragmentados (sin potencia infecciosa).Para inferir algo de importancia sobre la infectividad del virus, el gen Orf1, que codifica la enzima replicasa esencial de los virus del SARS-CoV, debería haberse incluido como diana (Figura 2). El posicionamiento de las dianas en la región del genoma viral que se transcribe de manera más intensa y variable es otra debilidad del protocolo.
Nota: hay una combinación perfecta de uno de los cebadores N con un patógeno clínico (Pantoea), que se encuentra en pacientes inmunodeprimidos. El cebador inverso también golpea a Pantoea, pero no en la misma región (Figura 3).
Estos son errores de diseño graves, ya que la prueba no puede discriminar entre el virus completo y los fragmentos virales. La prueba no se puede utilizar como diagnóstico para los virus del SARS.
Figura 2: Posiciones relativas de los objetivos de amplicón en el coronavirus del SARS y el genoma del nuevo coronavirus de 2019. ORF: marco de lectura abierto; RdRp: ARN polimerasa dependiente de ARN. Los números por debajo del amplicón son posiciones del genoma según SARS-CoV, NC_004718 [1];
Figura 3: Una prueba con la herramienta de red de dímeros de cebadores de Thermofischer revela que el cebador directo RdRp tiene una homología primaria de 6 pb en 3 'con Sarbeco E Reverse (cuadro de la izquierda). Otra prueba revela que existe una combinación perfecta de uno de los cebadores N con un patógeno clínico (Pantoea) que se encuentra en pacientes inmunodeprimidos (cuadro de la derecha).
2. Temperaturas de reacción
2a) Temperatura de fusión del ADN (> 92 °).
Abordado adecuadamente en el artículo de Corman-Drosten.
2b) temperatura de amplificación del ADN.
Abordado adecuadamente en el artículo de Corman-Drosten.
2c) Contenido de GC y Tm erróneos
Utilizamos el software de diseño de imprimaciones de uso gratuito Primer-BLAST [12, 25] para evaluar los valores de las mejores prácticas para todos los imprimadores utilizados en el artículo de Corman-Drosten (Tabla 3). Intentamos encontrar un valor de Tm de 60 ° C, mientras buscamos de manera similar el valor de% de GC más alto posible para todos los cebadores. Se consideró aceptable una diferencia máxima de Tm de 2 ° C dentro de los pares de cebadores. Al probar los pares de cebadores especificados en el artículo de Corman-Drosten, observamos una diferencia de 10 ° C con respecto a la temperatura de hibridación Tm para el par de cebadores1 (RdRp_SARSr_F y RdRp_SARSr_R). Este es un error muy grave y hace que el protocolo sea inútil como herramienta de diagnóstico específica.
Pruebas adicionales demostraron que solo el par de cebadores diseñado para amplificar el gen N (N_Sarbeco_F y N_Sarbeco_R) alcanzó el estándar adecuado para operar en una prueba de diagnóstico, ya que tiene suficiente contenido de GC y la diferencia de Tm entre los cebadores (N_Sarbeco_F y N_Sarbeco_R ) es de 1,85 ° C (por debajo del máximo crucial de 2 ° C de diferencia). Es importante destacar que este es el gen que no se probó en las muestras de virus (Tabla 2) ni se enfatizó como prueba de confirmación. Además de las temperaturas de fusión altamente variables y las secuencias degeneradas en estos cebadores, hay otro factor que afecta la especificidad del procedimiento: los dNTP (0,4 uM) son 2 veces más altos que los recomendados para una amplificación muy específica. También se añade sulfato de magnesio adicional a la reacción. Este procedimiento combinado con una temperatura de recocido baja puede crear amplificaciones no específicas. Cuando se requiere magnesio adicional para qPCR, la especificidad del ensayo debe examinarse más a fondo.
Los errores de diseño descritos aquí son tan graves que es muy poco probable que se produzca una amplificación específica del material genético del SARS-CoV-2 utilizando el protocolo del artículo de Corman-Drosten.
Tabla 3: Contenido de GC de los cebadores y sondas (adaptado del artículo de Corman-Drosten; se destacan las aberraciones del contenido de GC optimizado. El segundo panel muestra una lista de tablas de todos los valores de las mejores prácticas de Primer-BLAST para todos los cebadores y sondas utilizados en el artículo de Corman-Drosten del Prof.Dr. Ulrike Kämmerer y su equipo
3. El número de ciclos de amplificación
Cabe señalar que en ninguna parte del artículo de Corman-Drosten se menciona que una prueba sea positiva o negativa, o de hecho lo que define un resultado positivo o negativo. Estos tipos de pruebas de diagnóstico virológico deben basarse en un POE, incluido un número fijo y validado de ciclos de PCR (valor Ct) después de los cuales una muestra se considera positiva o negativa. El valor Ct máximo razonablemente confiable es de 30 ciclos. Por encima de un Ct de 35 ciclos, debe esperarse un número rápidamente creciente de falsos positivos.
Los datos de PCR evaluados como positivos después de un valor Ct de 35 ciclos son completamente poco fiables.
Citando a Jaafar et al. 2020 [3]: "En Ct = 35, el valor que usamos para informar un resultado positivo para la PCR, <3% de los cultivos son positivos". En otras palabras, no hubo un aislamiento exitoso del virus del SARS-CoV-2 con esos valores elevados de Ct.
Además, los estudios científicos muestran que solo se detectan virus no infecciosos (muertos) con valores de Ct de 35 [22].
Entre 30 y 35 hay una zona gris, donde no se puede establecer con certeza una prueba positiva. Esta área debe excluirse. Por supuesto, se podrían realizar 45 ciclos de PCR, como se recomienda en el protocolo de la OMS de Corman-Drosten (Figura 4), pero luego también hay que definir un valor Ct razonable (que no debe exceder los 30). Pero un resultado analítico con un valor Ct de 45 no tiene ningún significado científico y diagnóstico (un valor Ct razonable no debe exceder 30). Todo esto debe comunicarse con mucha claridad. Es un error significativo que el artículo de Corman-Drosten no mencione el valor máximo de Ct en el que una muestra puede considerarse inequívocamente como un resultado de prueba positivo o negativo. Este importante límite de umbral de ciclo tampoco se especifica en ninguna presentación de seguimiento hasta la fecha.
Figura 4: Recomendación del kit de RT-PCR en el protocolo oficial de la OMS de Corman-Drosten [8]. Sólo se puede encontrar un valor de “ciclador” (ciclos) sin un Ct (valor de corte) correspondiente y científicamente razonable. Este o cualquier otro valor de ciclos no se encuentra en ninguna parte del documento Corman-Drosten real.
4. Validaciones biomoleculares
Para determinar si los productos amplificados son realmente genes del SARS-CoV-2, es esencial la validación biomolecular de los productos de PCR amplificados. Para una prueba de diagnóstico, esta validación es una necesidad absoluta.
La validación de los productos de PCR se debe realizar procesando el producto de PCR en un gel de agarosa-EtBr al 1% junto con un indicador de tamaño (regla de ADN o escalera de ADN) para poder estimar el tamaño del producto. El tamaño debe corresponder al tamaño calculado del producto de amplificación. Pero es incluso mejor secuenciar el producto de amplificación. Este último dará un 100% de certeza sobre la identidad del producto de amplificación. Sin validación molecular, no se puede estar seguro de la identidad de los productos de PCR amplificados. Teniendo en cuenta los graves errores de diseño descritos anteriormente, los productos de PCR amplificados pueden ser cualquier cosa.
5. Controles positivos y negativos para confirmar / refutar la detección de virus específicos.
La suposición no confirmada descrita en el artículo de Corman-Drosten es que el SARS-CoV-2 es el único virus del grupo del beta-coronavirus similar al SARS que actualmente causa infecciones en humanos. Las secuencias en las que se basa su método de PCR son secuencias in silico, suministradas por un laboratorio en China [23], debido a que en el momento de desarrollo de la prueba de PCR no había material de control de SARS-CoV- infeccioso (“vivo”) o inactivado. 2 estaba disponible para los autores. Por lo tanto, la prueba de PCR se diseñó utilizando la secuencia del conocido SARS-CoV como material de control para el componente Sarbeco (Dr. Meijer, coautor del artículo Corman-Drosten en un intercambio de correo electrónico con el Dr. Peter Borger) [2].
En segundo lugar, y de gran relevancia, la funcionalidad de la prueba RT-PCR publicada no se demostró con el uso de un control positivo (ARN aislado del SARS-CoV-2), que es un estándar de oro científico esencial.
En tercer lugar, el artículo de Corman-Drosten afirma:
“Para demostrar que los ensayos pueden detectar otros virus relacionados con el SARS asociados a murciélagos, utilizamos el ensayo del gen E para analizar seis muestras fecales derivadas de murciélagos disponibles en Drexler et al. […] Und Muth et al. […]. Estas muestras positivas al virus procedían de murciélagos rinolófidos europeos. La detección de estos valores atípicos filogenéticos dentro del clado CoV relacionado con el SARS sugiere que es probable que se detecten todos los virus asiáticos. Teóricamente, esto garantizaría una amplia sensibilidad incluso en el caso de múltiples adquisiciones independientes de virus variantes de un reservorio animal ".
6. El procedimiento operativo estándar (POE) no está disponible
“En cuatro reacciones de prueba individuales, se observó una reactividad inicial débil, sin embargo, fueron negativas al volver a realizar la prueba con el mismo ensayo. Estas señales no se asociaron con ningún virus en particular, y para cada virus con el que se produjo una reactividad positiva inicial, hubo otras muestras que contenían el mismo virus en una concentración más alta pero no dieron positivo. Dados los resultados de la amplia calificación técnica descrita anteriormente, se concluyó que esta reactividad inicial no se debió a la inestabilidad química de las sondas de PCR en tiempo real y muy probablemente a problemas de manejo causados por la rápida introducción de nuevas pruebas de diagnóstico y controles durante esta evaluación. estudiar." [1]
8. El artículo de Corman-Drosten no fue revisado por pares.
Normalmente, la revisión por pares es un proceso que requiere mucho tiempo, ya que al menos dos expertos del campo tienen que leer y comentar críticamente el documento enviado. En nuestra opinión, este documento no fue revisado por pares. Veinticuatro horas simplemente no son suficientes para llevar a cabo una revisión exhaustiva por pares. Nuestra conclusión está respaldada por el hecho de que encontramos una gran cantidad de defectos de diseño muy graves, que hacen que la prueba de PCR sea completamente inadecuada como herramienta de diagnóstico para identificar el virus SARS-CoV-2. Cualquier biólogo molecular familiarizado con el diseño de RT-PCR habría observado fácilmente los graves errores presentes en el artículo de Corman-Drosten antes del proceso de revisión real. Le pedimos a Eurosurveillance el 26 de octubre de 2020 que nos enviara una copia del informe de revisión por pares. Hasta la fecha, no hemos recibido este informe y en una carta del 18 de noviembre de 2020, el ECDC como anfitrión de Eurosurveillance se negó a proporcionar acceso sin proporcionar razones científicas sustanciales para su decisión. Por el contrario, escriben que "la divulgación socavaría el propósito de las investigaciones científicas". [24].
9. Autores como editores
Un último punto es de gran preocupación. Resulta que dos autores del artículo de Corman-Drosten, Christian Drosten y Chantal Reusken, también son miembros del consejo editorial de esta revista [19]. Por lo tanto, existe un grave conflicto de intereses que refuerza las sospechas de que el documento no fue revisado por pares. Parece que la publicación rápida fue posible simplemente porque los autores también formaban parte del consejo editorial de Eurosurveillance. Esta práctica se clasifica como comprometida con la integridad científica.
CATÁLOGO RESUMEN DE ERRORES ENCONTRADOS EN EL DOCUMENTO
El documento de Corman-Drosten contiene los siguientes errores específicos:
1. No existe una razón específica para utilizar estas concentraciones extremadamente altas de cebadores en este protocolo. Las concentraciones descritas conducen a un aumento de las uniones inespecíficas y amplificaciones del producto de PCR, lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
2. Seis posiciones vacilantes no especificadas introducirán una enorme variabilidad en las implementaciones de laboratorio del mundo real de esta prueba; la descripción confusa e inespecífica en el documento de Corman-Drosten no es adecuada como protocolo operativo estándar, lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
3. La prueba no puede discriminar entre el virus completo y los fragmentos virales. Por lo tanto, la prueba no se puede utilizar como diagnóstico para virus intactos (infecciosos), lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2 y hacer inferencias sobre la presencia de una infección.
4. Una diferencia de 10 ° C con respecto a la temperatura de hibridación Tm para el par de cebadores1 (RdRp_SARSr_F y RdRp_SARSr_R) también hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
5. Un error grave es la omisión de un valor Ct en el que una muestra se considera positiva y negativa. Este valor Ct tampoco se encuentra en las presentaciones de seguimiento, lo que hace que la prueba no sea adecuada como una herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
6. Los productos de PCR no se han validado a nivel molecular. Este hecho hace que el protocolo sea inútil como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
7. La prueba de PCR no contiene un control positivo único para evaluar su especificidad para el SARS-CoV-2 ni un control negativo para excluir la presencia de otros coronavirus, lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el SARS-CoV-2. virus.
8. El diseño de prueba en el documento de Corman-Drosten es tan vago y defectuoso que uno puede ir en docenas de direcciones diferentes; nada está estandarizado y no hay POE. Esto cuestiona enormemente la validez científica de la prueba y la hace inadecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
9. Lo más probable es que el artículo de Corman-Drosten no haya sido revisado por pares, lo que hace que la prueba no sea adecuada como herramienta de diagnóstico específica para identificar el virus SARS-CoV-2.
10. Encontramos graves conflictos de interés para al menos cuatro autores, además de que dos de los autores del artículo de Corman-Drosten (Christian Drosten y Chantal Reusken) son miembros del consejo editorial de Eurosurveillance. Se agregó un conflicto de intereses el 29 de julio de 2020 (Olfert Landt es CEO de TIB-Molbiol; Marco Kaiser es investigador senior en GenExpress y se desempeña como asesor científico de TIB-Molbiol), que no se declaró en la versión original (y aún lo es falta en la versión de PubMed); TIB-Molbiol es la empresa que fue “la primera” en producir kits de PCR (Light Mix) basados en el protocolo publicado en el manuscrito de Corman-Drosten, y según sus propias palabras, distribuyeron estos kits de prueba de PCR antes de que se publicara la publicación. incluso presentado [20]; Además, Victor Corman y Christian Drosten no mencionó su segunda afiliación: el laboratorio de pruebas comerciales "Labor Berlin". Ambos son responsables del diagnóstico de virus allí [21] y la empresa opera en el ámbito de las pruebas de PCR en tiempo real.
A la luz de nuestro reexamen del protocolo de prueba para identificar el SARS-CoV-2 descrito en el documento de Corman-Drosten, hemos identificado errores y falacias inherentes que hacen que la prueba de PCR del SARS-CoV-2 sea inútil.
CONCLUSIÓN
La decisión sobre qué protocolos de prueba se publican y se ponen a disposición de todos está directamente en manos de Eurosurveillance. La decisión de reconocer los errores aparentes en el artículo de Corman-Drosten tiene el beneficio de minimizar en gran medida el costo humano y el sufrimiento en el futuro.
¿No le conviene a Eurosurveillance retractarse de este documento? Nuestra conclusión es clara. A la vista de todos los tremendos defectos y errores de diseño del protocolo de PCR descritos aquí, concluimos: No queda mucha elección en el marco de la integridad y la responsabilidad científicas.
REFERENCIAS
[1] Corman Victor M, Landt Olfert, Kaiser Marco, Molenkamp Richard, Meijer Adam, Chu Daniel KW, Bleicker Tobias, Brünink Sebastian, Schneider Julia, Schmidt Marie Luisa, Mulders Daphne GJC, Haagmans Bart L, van der Veer Bas, van den Brink Sharon, Wijsman Lisa, Goderski Gabriel, Romette Jean-Louis, Ellis Joanna, Zambon Maria, Peiris Malik, Goossens Herman, Reusken Chantal, Koopmans Marion PG, Drosten Christian. Detección del nuevo coronavirus de 2019 (2019-nCoV) mediante RT-PCR en tiempo real. Euro Surveill. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045
[2] Comunicación por correo electrónico entre el Dr. Peter Borger y el Dr. Adam Meijer: Material complementario
[3] Jafaar et al., Correlación entre 3790 muestras positivas de reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa y cultivos celulares positivos, incluidos 1941 aislados de coronavirus 2 de síndrome respiratorio agudo severo. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603
Nolan T, Huggett J, Sanchez E. Guía de buenas prácticas para la aplicación de PCR cuantitativa (qPCR) Primera edición 2013
[8] Trestan Pillonel et al, Carta al editor: detección de SARS-CoV-2 por RT-PCR en tiempo real: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/
[12] Primer-BLAST, NCBI - Centro Nacional de Información Biotecnológica: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
[16] Proceso de evaluación / revisión del documento de Eurosurveillance: https://www.eurosurveillance.org/evaluation
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